Применение гемопоэтических клеток эмбриональной печени человека при лечении больных раком головки поджелудочной железы, осложненным механической желтухой

Эмбриональные клеточные суспензии, содержащие стволовые клетки, применяются в последние десятилетия в терапии различных заболеваний благодаря своей способности восстанавливать клеточную массу и функциональную активность поврежденной ткани или органа. В качестве источника стволовых клеток гемопоэза используют обычно эмбриональную печень в возрасте 5-8 недель и эмбриональную селезенку 6-8 недель гестации.

Развитие рака головки поджелудочной железы с обструкцией желчных путей сопровождается выраженной депрессией кроветворной функции и иммунитета в результате токсического действия опухоли, интоксикации желчными кислотами, пигментами, а также угнетения функции печени. Частично эти явления уменьшаются в результате проведенного паллиативного хирургического лечения и детоксикационной терапии. При назначении химиотерапии угнетение гемопоэза и факторов иммунитета становится еще более выраженным и сопровождается миелодепрессией в виде глубокой лейкопении, агранулоцитоза, тромбоцитопении, что делает невозможным дальнейшее лечение цитостатическими препаратами. Иммунологическая несостоятельность приводит к развитию инфекционных осложнений. Кроме того, резко ухудшается качество жизни ввиду нарастания явлений интоксикации. Пациенты слабеют, худеют, постоянно находятся в постели, усиливаются явления соматической депрессии.

У нас имеется опыт использования гемопоэтических клеток эмбриональной печени человека (ГК ЭПЧ) в программах лечения онкологических больных на разных этапах развития онкологического процесса. Гемопоэтические клетки помогают провести радикальное лечение опухоли при наличии осложнений в виде анемии, лихорадки, истощения. После проведенных трансплантаций эти явления уменьшаются или исчезают. Эмбриональные клеточные суспензии, содержащие стволовые клетки гемопоэза, позволяют реконструировать гемопоэз после развития цитостатической миелодепрессии в ходе последующих курсов химиотерапии. Наконец, гемопоэтические клетки способны восстановить показатели иммунитета у пациентов, получивших курсы химиотерапии [4].

Уже через 6-8 часов после трансплантации у пациентов наблюдается синдром раннего посттрансплантационного улучшения в виде уменьшения слабости, снижения температуры, улучшения аппетита, повышения физической и умственной активности, изменения психофункционального статуса [3].

Материалы и методы. Эмбрионы 5-8 недель гестации получали в ходе медицинских абортов по социальным показаниям от здоровых женщин, предварительно обследованных на наличие вирусных и гемических инфекций. Клеточные суспензии из эмбриональной печени готовили в стерильных условиях бокса по стандартной методике, включающей следующие этапы: выделение эмбриональной печени, гомогенизация, фильтрация через фильтры для переливания крови и иглы уменьшающегося диаметра. Контейнеры с суспензией замораживали по программе и хранили при температуре -196°С.

Пренатальная диагностика включала в себя исследования на наличие сифилиса, ВИЧ-инфекции, вирусного гепатита В и С. Проводили исследования содержимого контейнеров на бактериальную стерильность. Фетальная диагностика включала исследования на наличие ВИЧ-инфекции, вирусного гепатита В и С, цитомегаловируса, вируса краснухи, герпеса и токсоплазмоза. Кровь доноров исследовалась также на ВИЧ-инфекцию через 90 дней после прерывания беременности.Ґ

Для трансплантации отбирали клеточные суспензии 5-8 недель гестации, с количеством клеток от 5 до 90?10⁶ в 1 мл, в объеме от 1 до 4,5 мл. Клеточную суспензию размораживали по программе и вводили внутривенно капельно [1].

Исследование субпопуляционного состава иммунокомпетентных клеток проводились при помощи непрямого иммунофлюоресцентного теста с панелями моноклональных антител серии Ley (Becton Dickinson, США), выявляющих поверхностные антигены кластеров CD3, CD4, CD8, CD16 и CD22. Исследования проводили на лазерном проточном цитофлюориметре Facstar Plus (Becton Dickinson, США). Обработка данных проводилась по программе «Facstar Plus».

Под наблюдением находилось 22 больных с раком головки поджелудочной железы, осложненным механической желтухой, которым была проведена операция билиодигестивного шунтирования с целью устранения холестаза. Средний возраст оперированных больных составил 65,1±3,3 года. Мужчин среди страдавших раком головки поджелудочной железы было в 1,8 раза больше, чем женщин. В первую группу вошли 12 пациентов с раком головки поджелудочной железы, после паллиативного хирургического лечения через 9-17 дней получивших базисную химиотерапию 5-фторурацилом и адриобластином. Во вторую группу вошли 10 пациентов, которым после хирургического лечения и курса химиотерапии через 8-14 дней была проведена трансплантация ГК ЭПЧ ввиду снижения одного из показателей периферической крови: лейкоцитов менее 4,0 Г/л, эритроцитов менее 3,0 Т/л, тромбоцитов менее 180 Г/л.

В качестве контрольных показателей использовались данные обследования группы из 11 грыженосителей в возрасте 57-69 лет.

Результаты и их обсуждение. Перед операцией в 1-ой и 2-ой группе больных наблюдали достоверное снижение по сравнению с контрольной группой следующих показателей (табл. 1 и 2, рис. 1): эритроцитов на 26% и 32%, гемоглобина на 15% и 12%, лейкоцитов на 19% и 30%, тромбоцитов на 23% и 30%, общего числа лимфоцитов на 18% (p>0,05) и 28%, Т-лимфоцитов (CD3+) на 31% и 40%, Т-хелперов (CD4+) на 6% (p>0,05) и 40%, Т-супрессоров (CD8+) на 40% и 69%, ЕК-клетки (CD16+) на 58% и 54%, соответственно. Иммунорегуляторный индекс после операции у пациентов 2 группы возрос до 3,01±0,24 (в 1,9 раза).
После операции постоянно проводилась терапия, направленная на уменьшение явлений воспаления, интоксикации, восстановления функции печени и желчевыводящих путей. У пациентов уменьшились явления желтушного синдрома и печеночно-клеточной недостаточности, исчезли признаки холемического синдрома.

Перед проведением курса химиотерапи в обеих группах отмечено статистически достоверное снижение эритроцитов в 1-ой группе на 19%, во 2-ой - на 27%, гемоглобина - соответственно на 26% и 24%, лейкоцитов - на 17% и 27%, тромбоцитов - на 24% и 32%, лимфоцитов - на 23% и 30%, Т-лимфоцитов - на 28% и 35%, Т-хелперов (CD4+) на 16% и 43%, Т-супрессоров (CD8+) в 3 раза и 3,7 раза соответственно. Таким образом, перед проведением курса химиотерапии основные показатели периферической крови и иммунологического статуса возросли на 10-20% кроме субпопуляции Т-супрессоров.

Пациенты обеих групп получили базисное химиотерапевтическое лечение 5-фторурацилом, внутривенно по 15 мг/кг массы тела до суммарной дозы 4,0 грамма и адриобластином, внутривенно по 50 мг/м2 поверхности тела в первый день каждого курса лечения. И в 1-ой и во 2-ой группах показатели периферической крови и клеточного иммунитета снизились в пределах от 10% до 40%. Так, например, количество лейкоцитов составило в 1-ой группе 2,84±0,24 Г/л, во 2-ой группе - 2,66±0,65 Г/л, эритроцитов - в 1-ой группе - 2,7±0,28 Т/л, во 2-ой - 2,31±0,25 Т/л, тромбоцитов в 1-ой группе 134,2±11,1 Г/л, во 2-ой группе - 118,1±12,9 Г/л. Продолжение курсов химиотерапии стало невозможным ввиду явлений цитостатической депрессии. 10 больным была проведена трансплантация ГК ЭПЧ.

В дальнейшем анализировались показатели периферической крови и иммунологического статуса через 1, 3, 6 и 9 месяцев после проведения первого курса химиотерапии. Пациентам 1-ой группы курсы химиотерапии более не проводились (наблюдения 1993-2001 г.). Пациентам 2-ой группы были проведены повторные курсы химиотерапии от 2 до 4 (наблюдения 1998-2001 г.).

Через 1 месяц у пациентов 2-ой группы количество лейкоцитов было выше на 63%, эритроцитов - на 18%, тромбоцитов - на 13%, общее количество лимфоцитов - на 77%, количество лимфоцитов CD3+ на 69%, лимфоцитов CD4+ - уменьшилось на 5%, CD8+ - возросло на 67%, CD22+ - на 33%, ЕК-клеток - в 5,4 раза по сравнению с аналогичными показателями у пациентов в 1-й группе.

Через 3 месяца, несмотря на проведение последующего курса химиотерапии, у больных 2-й группы определяемые показатели оказались выше по сравнению с аналогичными в 1-ой группе: лейкоцитов было на 29% выше, эритроцитов - на 20%, тромбоцитов - на 5%, общее количество лимфоцитов - на 25%, количество лимфоцитов CD3+ - на 25%, лимфоцитов CD4+ - меньше на 40%, количество CD8+ - возросло на 21%, CD22+ - на 28%, ЕК-клеток стало в 4 раза больше по сравнению с аналогичными показателями у пациентов в 1-й группе

Через 6 месяцев тенденция более высоких показателей красной и белой крови, тромбоцитов и показателей иммунитета сохранилась у больных, получивших трансплантацию ГК ЭПЧ. Эти показатели были настолько стабильные, что удалось провести третий курс химиотерапии.

Продолжительность жизни пациентов 1-ой группы составила 6,9±0,52 месяцев, поэтому в срок 9 месяцев оценивались показатели только у больных 2-ой группы. У них наблюдали лейкопению (3,09±0,49 Г/л), анемию средней степени тяжести (эритроциты 2,85±0,31 Т/л, гемоглобин 108,1±13 г/л), тромбоцитопению (124±8,7 Г/л), лимфопению (1,08±0,12 Г/л), снижение субпопуляций лимфоцитов CD3+, CD4+, CD8+, CD22+, CD16+ до крайне низких показателей. Продолжительность жизни пациентов 2-ой группы составила 10,1±0,56 мес.

Выводы:

1. Трансплантация ГК ЭПЧ при лечении больных раком головки поджелудочной железы, осложненным механической желтухой, позволяет частично восстановить показатели периферической крови: лейкоциты, эритроциты, тромбоциты. Кроме этого, улучшаются показатели клеточного иммунитета, возрастает общее количество лимфоцитов, а также их субпопуляций (CD3+, CD4+, CD8+, CD16+), нормализуется иммунорегуляторный индекс.
   
2. Применение ГК ЭПЧ позволяет провести планируемые курсы химиотерапии в полном объеме, что связано с появлением резистентности костного мозга к цитостатическим препаратам после введения эмбриональных стволовых клеток.
   
3. Применение ГК ЭПЧ в комплексном лечении больных раком головки поджелудочной железы, осложненным механической желтухой, включающем паллиативную операцию и курсы химиотерапии позволяет увеличить продолжительность жизни почти в 1,5 раза.

Таблица 1.

Гематологические и иммунологические показатели у больных 1-ой группы, которые прошли хирургическое лечение и химиотерапию.

Показатели				Эритро- циты	Гемо- глобин	Рети- куло- циты	Тромбо- циты	Лейко- циты	Лимфо- циты	Т-лимфо- циты, CD3+		Т-хелперы, CD4+		Т-супрес- соры, CD8+		CD4+/ CD8+	B-лимфо- циты, CD22+		EK-клетки, CD 16+
		n		1012/л	г/л	%	109/л	109/л	109/л	109/л	%	109/л	%	109/л	%		109/л	%	109/л	%
				1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13	14	15	16	17
Контроль		11	M	3,54	137	0,83	217	5,42	1,81	1,24	57,8	0,81	40,3	0,52	25,0	1,59	0,23	9,1	0,24	13,9
			±m	0,32	7,30	0,07	13,1	0,23	0,21	0,03	2,41	0,01	1,64	0,04	1,81	0,20	0,07	1,14	0,03	1,14
Перед операцией		12	M	2,68	116	0,28	167	4,38	1,49	0,86	58,1	0,76	35,7	0,31	18,3	2,26	0,18	12,2	0,10	5,7
			±m	0,21	8,12	0,02	18,4	0,12	0,07	0,07	5,23	0,07	2,14	0,01	1,28	0,27	0,02	0,73	0,01	0,34
			p1	x		x	x	x		x				x	x			x	x	x
Перед химио-терапией		12	M	2,87	102	0,47	164	4,49	1,39	0,89	57,7	0,85	42,7	0,17	15,5	4,89	0,17	12,1	0,06	4,2
			±m	0,23	8,16	0,04	13,1	0,36	0,13	0,15	5,19	0,07	2,56	0,01	2,17	0,39	0,02	0,97	0,01	0,34
			p1		x	x	x	x		x				x	x	x			x	x
Сроки обсле- дования после окончания химио-терапии	1 мес.	12	M	2,64	99	0,73	114	2,62	0,92	0,59	55,0	0,60	45,5	0,14	17,8	4,07	0,15	16,1	0,01	0,9
			±m	0,21	7,92	0,04	9,1	0,21	0,08	0,10	4,95	0,05	2,73	0,01	2,50	0,33	0,02	1,29	0,00	0,08
			p			x	x	x	x			x						x	x	x
			p1	x	x	x	x	x	x	x		x		x	x	x		x	x	x
	3 мес.	12	M	2,43	107	0,42	148	3,04	1,16	0,69	52,8	0,64	38,5	0,16	23,1	3,91	0,19	16,3	0,02	1,7
			±m	0,17	8,56	0,03	10,4	0,24	0,09	0,06	8,98	0,06	3,08	0,01	1,85	0,55	0,02	1,80	0,00	0,18
			p					x				x			x			x	x	x
			p1	x	x	x	x	x	x	x		x		x		x		x	x	x
	6 мес.	11*	M	2,42	101	0,31	156	3,42	0,92	0,50	44,6	0,60	45,5	0,10	16,8	5,62	0,09	10,2	0,02	2,3
			±m	0,19	8,08	0,03	12,5	0,27	0,07	0,04	3,56	0,05	7,74	0,01	1,34	0,34	0,01	1,43	0,00	0,32
			p			x		x	x	x	x	x		x			x		x	x
			p1	x	x	x	x	x	x	x	x	x	x	x	x	x			x	x

Примечание:
p - достоверность различий по сравнению с начальным уровнем (перед началом химиотерапии);
p1 - достоверность различий по сравнению с группой контроля;
x - коэффициент достоверности p<0,05;
* - один больной умер.

Таблица 2.

Гематологические и иммунологические показатели у больных 2-ой группы, которые прошли хирургическое лечение, химиотерапию и которым была проведена трансплантация ГК ЭПЧ после начала курсов химиотерапии.

Показатели				Эритро- циты	Гемо- глобин	Рети- куло- циты	Тромбо- циты	Лейко- циты	Лимфо- циты	Т- лимфо- циты, CD3+		Т- хелперы, CD4+		Т- супреc- соры, CD8+		CD4+/ CD8+	B-лимфо- циты, CD22+		EK-клетки, CD 16+
		n		1012/л	г/л	%	109/л	109/л	109/л	109/л	%	109/л	%	109/л	%		109/л	%	109/л	%
				1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13	14	15	16	17
Контроль		11	M	3,54	137	0,83	217	5,42	1,81	1,24	57,8	0,81	40,3	0,52	25,0	1,59	0,23	9,1	0,24	13,9
			m	0,32	7,30	0,07	13,1	0,23	0,21	0,03	2,41	0,01	1,64	0,04	1,81	0,20	0,07	1,14	0,03	1,14
Перед операцией		10	M	2,42	121	0,24	151	3,82	1,30	0,75	58,1	0,49	52,5	0,16	17,7	3,01	0,16	13,1	0,11	8,3
			±m	0,19	10,89	0,02	13,6	0,31	0,10	0,06	5,23	0,04	4,72	0,03	1,59	0,24	0,01	1,05	0,02	0,67
			p1	x		x	x	x	x	x		x	x	x	x	x		x	x	x
			p2									x	x	x		x				x
Перед химио-терапией		10	M	2,57	104	0,53	148	3,97	1,27	0,81	64,1	0,46	47,3	0,14	14,1	2,41	0,15	10,8	0,09	7,4
			±m	0,28	8,32	0,04	11,8	0,36	0,22	0,07	5,13	0,04	3,78	0,01	1,13	0,22	0,03	0,97	0,02	0,67
			p1	x	x	x	x	x		x		x		x	x	x			x	x
			p2									x				x				x
Перед трансплан-тацией		10	M	2,31	96	0,91	118	2,66	0,98	0,46	47,3	0,20	43,9	0,11	19,9	1,75	0,17	16,8	0,06	6,5
			±m	0,25	5,76	0,06	13,0	0,16	0,08	0,03	4,25	0,01	2,63	0,01	1,39	0,14	0,01	1,01	0,02	0,39
			p1	x	x		x	x	x	x	x	x		x	x			x	x	x
			p2			x	x	x	x	x		x		x		x		x		x
Сроки обследования после окончания химиотерапии	1 мес.	10	M	3,12	104	3,72	129	4,27	1,62	0,99	61,2	0,56	56,4	0,24	19,7	3,39	0,20	13,7	0,05	2,7
			±m	0,48	9,36	0,26	7,7	0,51	0,20	0,11	4,89	0,08	3,39	0,01	1,18	0,20	0,01	0,96	0,01	0,19
			p			x								x	x	x	x	x	x	x
			p1		x	x	x	x		x		x	x	x	x	x		x	x	x
			p2			x		x	x	x			x	x			x		x	x
	3 мес.	10	M	2,91	109	1,73	155	3,91	1,45	0,87	60,3	0,38	43,9	0,19	18,3	1,91	0,24	16,4	0,11	8,4
			±m	0,26	15,26	0,12	17,1	0,24	1,30	0,10	6,63	0,03	3,51	0,01	1,10	0,12	0,01	0,98	0,04	0,50
			p			x								x	x	x	x	x
			p1			x	x	x		x		x		x	x			x	x	x
			p2			x		x				x		x	x	x	x		x	x
	6 мес.	9*	M	2,95	118	1,04	162	3,56	1,35	0,81	60,3	0,36	43,9	0,20	19,9	1,75	0,19	14,1	0,03	1,8
			±m	0,10	6,70	0,07	13,0	0,39	0,11	0,07	4,82	0,03	3,51	0,02	1,39	0,14	0,01	0,85	0,01	0,11
			p			x						x		x	x	x		x	x	x
			p1			x	x	x		x		x		x	x			x	x
			p2	x		x			x	x	x	x		x		x	x	x
	9 мес.	8**	M	2,85	108	0,78	124	3,09	1,08	0,65	60,3	0,35	54,0	0,12	15,8	2,76	0,15	14,2	0,04	4,4
			±m	0,31	12,96	0,06	8,7	0,49	0,12	0,10	6,03	0,04	4,86	0,01	2,05	0,22	0,02	1,99	0,01	0,61
			p			x						x							x	x
			p1				x	x	x	x		x	x	x	x	x		x	x	x

Примечание:
p - достоверность различий по сравнению с начальным уровнем (перед началом химиотерапии);
p1 - достоверность различий по сравнению с группой контроля;
p2 - достоверность различий в сравнении с показателями 1 группы;
x - коэффициент достоверности p<0,05;
* - один больной умер;
** - один больной умер и один не явился на обследование.