Эмбриональные клеточные суспензии, содержащие стволовые клетки, применяются в последние десятилетия в терапии различных заболеваний благодаря своей способности восстанавливать клеточную массу и функциональную активность поврежденной ткани или органа. В качестве источника стволовых клеток гемопоэза используют обычно эмбриональную печень в возрасте 5-8 недель и эмбриональную селезенку 6-8 недель гестации.
Развитие рака головки поджелудочной железы с обструкцией желчных путей сопровождается выраженной депрессией кроветворной функции и иммунитета в результате токсического действия опухоли, интоксикации желчными кислотами, пигментами, а также угнетения функции печени. Частично эти явления уменьшаются в результате проведенного паллиативного хирургического лечения и детоксикационной терапии. При назначении химиотерапии угнетение гемопоэза и факторов иммунитета становится еще более выраженным и сопровождается миелодепрессией в виде глубокой лейкопении, агранулоцитоза, тромбоцитопении, что делает невозможным дальнейшее лечение цитостатическими препаратами. Иммунологическая несостоятельность приводит к развитию инфекционных осложнений. Кроме того, резко ухудшается качество жизни ввиду нарастания явлений интоксикации. Пациенты слабеют, худеют, постоянно находятся в постели, усиливаются явления соматической депрессии.
У нас имеется опыт использования гемопоэтических клеток эмбриональной печени человека (ГК ЭПЧ) в программах лечения онкологических больных на разных этапах развития онкологического процесса. Гемопоэтические клетки помогают провести радикальное лечение опухоли при наличии осложнений в виде анемии, лихорадки, истощения. После проведенных трансплантаций эти явления уменьшаются или исчезают. Эмбриональные клеточные суспензии, содержащие стволовые клетки гемопоэза, позволяют реконструировать гемопоэз после развития цитостатической миелодепрессии в ходе последующих курсов химиотерапии. Наконец, гемопоэтические клетки способны восстановить показатели иммунитета у пациентов, получивших курсы химиотерапии [4].
Уже через 6-8 часов после трансплантации у пациентов наблюдается синдром раннего посттрансплантационного улучшения в виде уменьшения слабости, снижения температуры, улучшения аппетита, повышения физической и умственной активности, изменения психофункционального статуса [3].
Материалы и методы. Эмбрионы 5-8 недель гестации получали в ходе медицинских абортов по социальным показаниям от здоровых женщин, предварительно обследованных на наличие вирусных и гемических инфекций. Клеточные суспензии из эмбриональной печени готовили в стерильных условиях бокса по стандартной методике, включающей следующие этапы: выделение эмбриональной печени, гомогенизация, фильтрация через фильтры для переливания крови и иглы уменьшающегося диаметра. Контейнеры с суспензией замораживали по программе и хранили при температуре -196°С.
Пренатальная диагностика включала в себя исследования на наличие сифилиса, ВИЧ-инфекции, вирусного гепатита В и С. Проводили исследования содержимого контейнеров на бактериальную стерильность. Фетальная диагностика включала исследования на наличие ВИЧ-инфекции, вирусного гепатита В и С, цитомегаловируса, вируса краснухи, герпеса и токсоплазмоза. Кровь доноров исследовалась также на ВИЧ-инфекцию через 90 дней после прерывания беременности.Ґ
Для трансплантации отбирали клеточные суспензии 5-8 недель гестации, с количеством клеток от 5 до 90?10
6 в 1 мл, в объеме от 1 до 4,5 мл. Клеточную суспензию размораживали по программе и вводили внутривенно капельно [1].
Исследование субпопуляционного состава иммунокомпетентных клеток проводились при помощи непрямого иммунофлюоресцентного теста с панелями моноклональных антител серии Ley (Becton Dickinson, США), выявляющих поверхностные антигены кластеров CD3, CD4, CD8, CD16 и CD22. Исследования проводили на лазерном проточном цитофлюориметре Facstar Plus (Becton Dickinson, США). Обработка данных проводилась по программе «Facstar Plus».
Под наблюдением находилось 22 больных с раком головки поджелудочной железы, осложненным механической желтухой, которым была проведена операция билиодигестивного шунтирования с целью устранения холестаза. Средний возраст оперированных больных составил 65,1±3,3 года. Мужчин среди страдавших раком головки поджелудочной железы было в 1,8 раза больше, чем женщин. В первую группу вошли 12 пациентов с раком головки поджелудочной железы, после паллиативного хирургического лечения через 9-17 дней получивших базисную химиотерапию 5-фторурацилом и адриобластином. Во вторую группу вошли 10 пациентов, которым после хирургического лечения и курса химиотерапии через 8-14 дней была проведена трансплантация ГК ЭПЧ ввиду снижения одного из показателей периферической крови: лейкоцитов менее 4,0 Г/л, эритроцитов менее 3,0 Т/л, тромбоцитов менее 180 Г/л.
В качестве контрольных показателей использовались данные обследования группы из 11 грыженосителей в возрасте 57-69 лет.
Результаты и их обсуждение. Перед операцией в 1-ой и 2-ой группе больных наблюдали достоверное снижение по сравнению с контрольной группой следующих показателей (табл. 1 и 2, рис. 1): эритроцитов на 26% и 32%, гемоглобина на 15% и 12%, лейкоцитов на 19% и 30%, тромбоцитов на 23% и 30%, общего числа лимфоцитов на 18% (p>0,05) и 28%, Т-лимфоцитов (CD3+) на 31% и 40%, Т-хелперов (CD4+) на 6% (p>0,05) и 40%, Т-супрессоров (CD8+) на 40% и 69%, ЕК-клетки (CD16+) на 58% и 54%, соответственно. Иммунорегуляторный индекс после операции у пациентов 2 группы возрос до 3,01±0,24 (в 1,9 раза).
После операции постоянно проводилась терапия, направленная на уменьшение явлений воспаления, интоксикации, восстановления функции печени и желчевыводящих путей. У пациентов уменьшились явления желтушного синдрома и печеночно-клеточной недостаточности, исчезли признаки холемического синдрома.
Перед проведением курса химиотерапи в обеих группах отмечено статистически достоверное снижение эритроцитов в 1-ой группе на 19%, во 2-ой - на 27%, гемоглобина - соответственно на 26% и 24%, лейкоцитов - на 17% и 27%, тромбоцитов - на 24% и 32%, лимфоцитов - на 23% и 30%, Т-лимфоцитов - на 28% и 35%, Т-хелперов (CD4+) на 16% и 43%, Т-супрессоров (CD8+) в 3 раза и 3,7 раза соответственно. Таким образом, перед проведением курса химиотерапии основные показатели периферической крови и иммунологического статуса возросли на 10-20% кроме субпопуляции Т-супрессоров.
Пациенты обеих групп получили базисное химиотерапевтическое лечение 5-фторурацилом, внутривенно по 15 мг/кг массы тела до суммарной дозы 4,0 грамма и адриобластином, внутривенно по 50 мг/м2 поверхности тела в первый день каждого курса лечения. И в 1-ой и во 2-ой группах показатели периферической крови и клеточного иммунитета снизились в пределах от 10% до 40%. Так, например, количество лейкоцитов составило в 1-ой группе 2,84±0,24 Г/л, во 2-ой группе - 2,66±0,65 Г/л, эритроцитов - в 1-ой группе - 2,7±0,28 Т/л, во 2-ой - 2,31±0,25 Т/л, тромбоцитов в 1-ой группе 134,2±11,1 Г/л, во 2-ой группе - 118,1±12,9 Г/л. Продолжение курсов химиотерапии стало невозможным ввиду явлений цитостатической депрессии. 10 больным была проведена трансплантация ГК ЭПЧ.
В дальнейшем анализировались показатели периферической крови и иммунологического статуса через 1, 3, 6 и 9 месяцев после проведения первого курса химиотерапии. Пациентам 1-ой группы курсы химиотерапии более не проводились (наблюдения 1993-2001 г.). Пациентам 2-ой группы были проведены повторные курсы химиотерапии от 2 до 4 (наблюдения 1998-2001 г.).
Через 1 месяц у пациентов 2-ой группы количество лейкоцитов было выше на 63%, эритроцитов - на 18%, тромбоцитов - на 13%, общее количество лимфоцитов - на 77%, количество лимфоцитов CD3+ на 69%, лимфоцитов CD4+ - уменьшилось на 5%, CD8+ - возросло на 67%, CD22+ - на 33%, ЕК-клеток - в 5,4 раза по сравнению с аналогичными показателями у пациентов в 1-й группе.
Через 3 месяца, несмотря на проведение последующего курса химиотерапии, у больных 2-й группы определяемые показатели оказались выше по сравнению с аналогичными в 1-ой группе: лейкоцитов было на 29% выше, эритроцитов - на 20%, тромбоцитов - на 5%, общее количество лимфоцитов - на 25%, количество лимфоцитов CD3+ - на 25%, лимфоцитов CD4+ - меньше на 40%, количество CD8+ - возросло на 21%, CD22+ - на 28%, ЕК-клеток стало в 4 раза больше по сравнению с аналогичными показателями у пациентов в 1-й группе
Через 6 месяцев тенденция более высоких показателей красной и белой крови, тромбоцитов и показателей иммунитета сохранилась у больных, получивших трансплантацию ГК ЭПЧ. Эти показатели были настолько стабильные, что удалось провести третий курс химиотерапии.
Продолжительность жизни пациентов 1-ой группы составила 6,9±0,52 месяцев, поэтому в срок 9 месяцев оценивались показатели только у больных 2-ой группы. У них наблюдали лейкопению (3,09±0,49 Г/л), анемию средней степени тяжести (эритроциты 2,85±0,31 Т/л, гемоглобин 108,1±13 г/л), тромбоцитопению (124±8,7 Г/л), лимфопению (1,08±0,12 Г/л), снижение субпопуляций лимфоцитов CD3+, CD4+, CD8+, CD22+, CD16+ до крайне низких показателей. Продолжительность жизни пациентов 2-ой группы составила 10,1±0,56 мес.
Выводы:
- Трансплантация ГК ЭПЧ при лечении больных раком головки поджелудочной железы, осложненным механической желтухой, позволяет частично восстановить показатели периферической крови: лейкоциты, эритроциты, тромбоциты. Кроме этого, улучшаются показатели клеточного иммунитета, возрастает общее количество лимфоцитов, а также их субпопуляций (CD3+, CD4+, CD8+, CD16+), нормализуется иммунорегуляторный индекс.
- Применение ГК ЭПЧ позволяет провести планируемые курсы химиотерапии в полном объеме, что связано с появлением резистентности костного мозга к цитостатическим препаратам после введения эмбриональных стволовых клеток.
- Применение ГК ЭПЧ в комплексном лечении больных раком головки поджелудочной железы, осложненным механической желтухой, включающем паллиативную операцию и курсы химиотерапии позволяет увеличить продолжительность жизни почти в 1,5 раза.
Таблица 1.
Гематологические и иммунологические показатели у больных 1-ой группы, которые прошли хирургическое лечение и химиотерапию.
Показатели |
Эритро-
циты |
Гемо-
глобин |
Рети-
куло-
циты |
Тромбо-
циты |
Лейко-
циты |
Лимфо-
циты |
Т-лимфо-
циты, CD3+ |
Т-хелперы, CD4+ |
Т-супрес-
соры, CD8+ |
CD4+/ CD8+ |
B-лимфо-
циты, CD22+ |
EK-клетки, CD 16+ |
|
n |
|
1012/л |
г/л |
% |
109/л |
109/л |
109/л |
109/л |
% |
109/л |
% |
109/л |
% |
|
109/л |
% |
109/л |
% |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
10 |
11 |
12 |
13 |
14 |
15 |
16 |
17 |
Контроль |
11 |
M |
3,54 |
137 |
0,83 |
217 |
5,42 |
1,81 |
1,24 |
57,8 |
0,81 |
40,3 |
0,52 |
25,0 |
1,59 |
0,23 |
9,1 |
0,24 |
13,9 |
±m |
0,32 |
7,30 |
0,07 |
13,1 |
0,23 |
0,21 |
0,03 |
2,41 |
0,01 |
1,64 |
0,04 |
1,81 |
0,20 |
0,07 |
1,14 |
0,03 |
1,14 |
Перед операцией |
12 |
M |
2,68 |
116 |
0,28 |
167 |
4,38 |
1,49 |
0,86 |
58,1 |
0,76 |
35,7 |
0,31 |
18,3 |
2,26 |
0,18 |
12,2 |
0,10 |
5,7 |
±m |
0,21 |
8,12 |
0,02 |
18,4 |
0,12 |
0,07 |
0,07 |
5,23 |
0,07 |
2,14 |
0,01 |
1,28 |
0,27 |
0,02 |
0,73 |
0,01 |
0,34 |
p1 |
x |
|
x |
x |
x |
|
x |
|
|
|
x |
x |
|
|
x |
x |
x |
Перед химио-терапией |
12 |
M |
2,87 |
102 |
0,47 |
164 |
4,49 |
1,39 |
0,89 |
57,7 |
0,85 |
42,7 |
0,17 |
15,5 |
4,89 |
0,17 |
12,1 |
0,06 |
4,2 |
±m |
0,23 |
8,16 |
0,04 |
13,1 |
0,36 |
0,13 |
0,15 |
5,19 |
0,07 |
2,56 |
0,01 |
2,17 |
0,39 |
0,02 |
0,97 |
0,01 |
0,34 |
p1 |
|
x |
x |
x |
x |
|
x |
|
|
|
x |
x |
x |
|
|
x |
x |
Сроки обсле-
дования после окончания химио-терапии |
1 мес. |
12 |
M |
2,64 |
99 |
0,73 |
114 |
2,62 |
0,92 |
0,59 |
55,0 |
0,60 |
45,5 |
0,14 |
17,8 |
4,07 |
0,15 |
16,1 |
0,01 |
0,9 |
±m |
0,21 |
7,92 |
0,04 |
9,1 |
0,21 |
0,08 |
0,10 |
4,95 |
0,05 |
2,73 |
0,01 |
2,50 |
0,33 |
0,02 |
1,29 |
0,00 |
0,08 |
p |
|
|
x |
x |
x |
x |
|
|
x |
|
|
|
|
|
x |
x |
x |
p1 |
x |
x |
x |
x |
x |
x |
x |
|
x |
|
x |
x |
x |
|
x |
x |
x |
3 мес. |
12 |
M |
2,43 |
107 |
0,42 |
148 |
3,04 |
1,16 |
0,69 |
52,8 |
0,64 |
38,5 |
0,16 |
23,1 |
3,91 |
0,19 |
16,3 |
0,02 |
1,7 |
±m |
0,17 |
8,56 |
0,03 |
10,4 |
0,24 |
0,09 |
0,06 |
8,98 |
0,06 |
3,08 |
0,01 |
1,85 |
0,55 |
0,02 |
1,80 |
0,00 |
0,18 |
p |
|
|
|
|
x |
|
|
|
x |
|
|
x |
|
|
x |
x |
x |
p1 |
x |
x |
x |
x |
x |
x |
x |
|
x |
|
x |
|
x |
|
x |
x |
x |
6 мес. |
11* |
M |
2,42 |
101 |
0,31 |
156 |
3,42 |
0,92 |
0,50 |
44,6 |
0,60 |
45,5 |
0,10 |
16,8 |
5,62 |
0,09 |
10,2 |
0,02 |
2,3 |
±m |
0,19 |
8,08 |
0,03 |
12,5 |
0,27 |
0,07 |
0,04 |
3,56 |
0,05 |
7,74 |
0,01 |
1,34 |
0,34 |
0,01 |
1,43 |
0,00 |
0,32 |
p |
|
|
x |
|
x |
x |
x |
x |
x |
|
x |
|
|
x |
|
x |
x |
p1 |
x |
x |
x |
x |
x |
x |
x |
x |
x |
x |
x |
x |
x |
|
|
x |
x |
Примечание:
p - достоверность различий по сравнению с начальным уровнем (перед началом химиотерапии);
p1 - достоверность различий по сравнению с группой контроля;
x - коэффициент достоверности p<0,05;
* - один больной умер.
Таблица 2.
Гематологические и иммунологические показатели у больных 2-ой группы, которые прошли хирургическое лечение, химиотерапию и которым была проведена трансплантация ГК ЭПЧ после начала курсов химиотерапии.
Показатели |
Эритро-
циты |
Гемо-
глобин |
Рети-
куло-
циты |
Тромбо-
циты |
Лейко-
циты |
Лимфо-
циты |
Т- лимфо-
циты, CD3+ |
Т- хелперы, CD4+ |
Т- супреc-
соры, CD8+ |
CD4+/ CD8+ |
B-лимфо-
циты, CD22+ |
EK-клетки, CD 16+ |
|
n |
|
1012/л |
г/л |
% |
109/л |
109/л |
109/л |
109/л |
% |
109/л |
% |
109/л |
% |
|
109/л |
% |
109/л |
% |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
10 |
11 |
12 |
13 |
14 |
15 |
16 |
17 |
Контроль |
11 |
M |
3,54 |
137 |
0,83 |
217 |
5,42 |
1,81 |
1,24 |
57,8 |
0,81 |
40,3 |
0,52 |
25,0 |
1,59 |
0,23 |
9,1 |
0,24 |
13,9 |
m |
0,32 |
7,30 |
0,07 |
13,1 |
0,23 |
0,21 |
0,03 |
2,41 |
0,01 |
1,64 |
0,04 |
1,81 |
0,20 |
0,07 |
1,14 |
0,03 |
1,14 |
Перед операцией |
10 |
M |
2,42 |
121 |
0,24 |
151 |
3,82 |
1,30 |
0,75 |
58,1 |
0,49 |
52,5 |
0,16 |
17,7 |
3,01 |
0,16 |
13,1 |
0,11 |
8,3 |
±m |
0,19 |
10,89 |
0,02 |
13,6 |
0,31 |
0,10 |
0,06 |
5,23 |
0,04 |
4,72 |
0,03 |
1,59 |
0,24 |
0,01 |
1,05 |
0,02 |
0,67 |
p1 |
x |
|
x |
x |
x |
x |
x |
|
x |
x |
x |
x |
x |
|
x |
x |
x |
p2 |
|
|
|
|
|
|
|
|
x |
x |
x |
|
x |
|
|
|
x |
Перед химио-терапией |
10 |
M |
2,57 |
104 |
0,53 |
148 |
3,97 |
1,27 |
0,81 |
64,1 |
0,46 |
47,3 |
0,14 |
14,1 |
2,41 |
0,15 |
10,8 |
0,09 |
7,4 |
±m |
0,28 |
8,32 |
0,04 |
11,8 |
0,36 |
0,22 |
0,07 |
5,13 |
0,04 |
3,78 |
0,01 |
1,13 |
0,22 |
0,03 |
0,97 |
0,02 |
0,67 |
p1 |
x |
x |
x |
x |
x |
|
x |
|
x |
|
x |
x |
x |
|
|
x |
x |
p2 |
|
|
|
|
|
|
|
|
x |
|
|
|
x |
|
|
|
x |
Перед трансплан-тацией |
10 |
M |
2,31 |
96 |
0,91 |
118 |
2,66 |
0,98 |
0,46 |
47,3 |
0,20 |
43,9 |
0,11 |
19,9 |
1,75 |
0,17 |
16,8 |
0,06 |
6,5 |
±m |
0,25 |
5,76 |
0,06 |
13,0 |
0,16 |
0,08 |
0,03 |
4,25 |
0,01 |
2,63 |
0,01 |
1,39 |
0,14 |
0,01 |
1,01 |
0,02 |
0,39 |
p1 |
x |
x |
|
x |
x |
x |
x |
x |
x |
|
x |
x |
|
|
x |
x |
x |
p2 |
|
|
x |
x |
x |
x |
x |
|
x |
|
x |
|
x |
|
x |
|
x |
Сроки обследования после окончания химиотерапии |
1 мес. |
10 |
M |
3,12 |
104 |
3,72 |
129 |
4,27 |
1,62 |
0,99 |
61,2 |
0,56 |
56,4 |
0,24 |
19,7 |
3,39 |
0,20 |
13,7 |
0,05 |
2,7 |
±m |
0,48 |
9,36 |
0,26 |
7,7 |
0,51 |
0,20 |
0,11 |
4,89 |
0,08 |
3,39 |
0,01 |
1,18 |
0,20 |
0,01 |
0,96 |
0,01 |
0,19 |
p |
|
|
x |
|
|
|
|
|
|
|
x |
x |
x |
x |
x |
x |
x |
p1 |
|
x |
x |
x |
x |
|
x |
|
x |
x |
x |
x |
x |
|
x |
x |
x |
p2 |
|
|
x |
|
x |
x |
x |
|
|
x |
x |
|
|
x |
|
x |
x |
3 мес. |
10 |
M |
2,91 |
109 |
1,73 |
155 |
3,91 |
1,45 |
0,87 |
60,3 |
0,38 |
43,9 |
0,19 |
18,3 |
1,91 |
0,24 |
16,4 |
0,11 |
8,4 |
±m |
0,26 |
15,26 |
0,12 |
17,1 |
0,24 |
1,30 |
0,10 |
6,63 |
0,03 |
3,51 |
0,01 |
1,10 |
0,12 |
0,01 |
0,98 |
0,04 |
0,50 |
p |
|
|
x |
|
|
|
|
|
|
|
x |
x |
x |
x |
x |
|
|
p1 |
|
|
x |
x |
x |
|
x |
|
x |
|
x |
x |
|
|
x |
x |
x |
p2 |
|
|
x |
|
x |
|
|
|
x |
|
x |
x |
x |
x |
|
x |
x |
6 мес. |
9* |
M |
2,95 |
118 |
1,04 |
162 |
3,56 |
1,35 |
0,81 |
60,3 |
0,36 |
43,9 |
0,20 |
19,9 |
1,75 |
0,19 |
14,1 |
0,03 |
1,8 |
±m |
0,10 |
6,70 |
0,07 |
13,0 |
0,39 |
0,11 |
0,07 |
4,82 |
0,03 |
3,51 |
0,02 |
1,39 |
0,14 |
0,01 |
0,85 |
0,01 |
0,11 |
p |
|
|
x |
|
|
|
|
|
x |
|
x |
x |
x |
|
x |
x |
x |
p1 |
|
|
x |
x |
x |
|
x |
|
x |
|
x |
x |
|
|
x |
x |
p2 |
x |
|
x |
|
|
x |
x |
x |
x |
|
x |
|
x |
x |
x |
|
|
9 мес. |
8** |
M |
2,85 |
108 |
0,78 |
124 |
3,09 |
1,08 |
0,65 |
60,3 |
0,35 |
54,0 |
0,12 |
15,8 |
2,76 |
0,15 |
14,2 |
0,04 |
4,4 |
±m |
0,31 |
12,96 |
0,06 |
8,7 |
0,49 |
0,12 |
0,10 |
6,03 |
0,04 |
4,86 |
0,01 |
2,05 |
0,22 |
0,02 |
1,99 |
0,01 |
0,61 |
p |
|
|
x |
|
|
|
|
|
x |
|
|
|
|
|
|
x |
x |
p1 |
|
|
|
x |
x |
x |
x |
|
x |
x |
x |
x |
x |
|
x |
x |
x |
Примечание:
p - достоверность различий по сравнению с начальным уровнем (перед началом химиотерапии);
p1 - достоверность различий по сравнению с группой контроля;
p2 - достоверность различий в сравнении с показателями 1 группы;
x - коэффициент достоверности p<0,05;
* - один больной умер;
** - один больной умер и один не явился на обследование.